【獸藥名稱】
通用名 禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
商品名 無
英文名 Avian Influenza Virus H5 Subtype RT-PCR Detection kit
漢語拼音 Qinliugan Bingdu H5yaxing RT-PCR Jianceshijihe
【主要成分與含量】
變性液6mL×1瓶、酚/氯仿/異戊醇混合液6mL×1瓶、異丙醇9mL×1瓶、75%乙醇10mL×2瓶、DEPC水500μl×1管、2mol/L醋酸鈉溶液（pH值4.0）700μl×1管、陽性對照100μl×1管、陰性對照100μl×1管、RT-PCR反應(yīng)體系22.5μl×22管、6倍上樣緩沖液 100μl×1管、擴(kuò)增對照30μl×1管。
【作用與用途】
用于H5亞型禽流感病毒的檢測。適用于可能感染H5亞型禽流感病毒的咽喉拭子、泄殖腔拭子、組織、雞胚尿囊液以及細(xì)胞培養(yǎng)物中H5亞型禽流感病毒RNA的檢測。
【用法與判定】
1 取1.5mL DEPC處理過的離心管，加入待檢樣品100μl,加300μl變性液，繼續(xù)加入30μl 2mol/L醋酸鈉（pH值4.0）。反復(fù)顛倒離心管4~5次，以混合均勻。
2 加入酚/氯仿/異戊醇混合液300μl,反復(fù)顛倒離心管3~5次，再搖晃10秒，置冰上靜置15分鐘。
3 4℃ 12000r/min離心20分鐘，吸取上清置另一個(gè)離心管中。
4 加入等體積的異丙醇，-20℃靜置10~15分鐘，沉淀RNA.
5 4℃ 12000r/min離心10分鐘。棄上清，加入75%的冰乙醇，溫和地反復(fù)顛倒離心管3~5次。
6 4℃ 12000r/min離心5分鐘。棄上清，用濾紙吸干管壁余液，真空抽干或者37℃烘干5~20分鐘。
7 加入10μl DEPC水，溶解RNA.
8 取2.5μl RNA轉(zhuǎn)移到RT-PCR反應(yīng)體系管中。
9 置于PCR儀中，循環(huán)參數(shù)為45℃逆轉(zhuǎn)錄45分鐘，94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 30秒、52℃ 45秒、68℃ 45秒，35個(gè)循環(huán)，68℃延伸8分鐘。
10 取5μl PCR產(chǎn)物，混合1μl 上樣緩沖液，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。以DNA分子量Marker為參考。
11 結(jié)果判定，同時(shí)出現(xiàn)372bp和229bp大小的擴(kuò)增片段時(shí)，判定為H5血凝素亞型禽流感病毒陽性，只出現(xiàn)229bp片段判定為其它亞型A型流感病毒陽性，只出現(xiàn)372bp定為H5亞型疑似，不出條帶，判定為陰性。
【注意事項(xiàng)】
（1）本試劑盒RNA提取液2~8℃存放；RT-PCR反應(yīng)體系-20℃以下存放。盡量不要反復(fù)凍融。
（2）RT-PCR反應(yīng)體系，用前要先在冰上徹底溶化，并瞬時(shí)離心將液體甩至管底。
（3）病料的處理很重要，現(xiàn)地采集的病料，先進(jìn)行研磨，再按照每克重量加入1mL PBS,混勻，按10-1~10-2比例稀釋后用于RNA的提取。棉拭子病料直接加入1mL PBS,混合后取溶液用于RNA的提取，不需要稀釋。
（4）RNA的提取直接會(huì)影響到RT-PCR結(jié)果，需要特別注意RNA提取過程的操作。
（5）注意廢棄物的無害化處理？梢纱龣z樣品及其接觸過器材要消毒滅菌，防止實(shí)驗(yàn)室散毒；含有EB的物品需要高溫處理。
（6）注意防止PCR操作過程中的環(huán)境污染，有條件情況下可以采用獨(dú)立房間分別進(jìn)行RNA提取、RT-PCR、電泳等操作環(huán)節(jié)，無條件時(shí)應(yīng)該盡可能劃分不同功能的工作區(qū)，并且電泳時(shí)采用單獨(dú)移液器。
【廢棄包裝處理措施】
剩余的試劑及空瓶不能隨意丟棄，須經(jīng)加熱或消毒滅菌后方可廢棄。
【規(guī)格】
20份/盒。
【貯藏與有效期】
RNA提取試劑置2~8℃保存；RT-PCR反應(yīng)體系置-20℃以下保存。有效期6個(gè)月。
【批準(zhǔn)文號】
獸藥生字（2006）080018075
【生產(chǎn)企業(yè)】
哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司